Mons. Ambrogio Spreafico è nato a Garbagnate Monastero, in provincia  di Lecco e nell'arcidiocesi di Milano, il 26 marzo 1950. Ha percorso  tutto il curriculum studiorum presso la Congregazione dei Chierici Regolari di San Paolo (Padri Barnabiti).

È stato ordinato sacerdote il 12 aprile 1975. Ha seguito i corsi di  filosofia e di teologia presso la Pontificia Università Urbaniana e quelli di teologia biblica presso il Pontificio Istituto Biblico di Roma, dove ha ottenuto la Licenza in Sacra Scrittura, nel 1978, e successivamente il Dottorato, nel 1984.

Nel 1976 si è incardinato nella diocesi di Palestrina e, in seguito, in quella di Roma (15 novembre 1988), dove risiede ed esercita il suo ministero sacerdotale.

Ha svolto i seguenti incarichi: Docente di lingua ebraica al Pontificio Istituto Biblico di Roma (1978-1991); dal 1992 Docente di Antico Testamento alla Facoltà Teologica della Pontificia Università Urbaniana; Rettore Magnifico della medesima Università (1997-2003); Presidente della Conferenza dei Rettori delle Università Pontificie Romane (2000-2003); dal 1993 Collaboratore parrocchiale di Santa Maria in Trastevere; dal 1998 Consultore della Congregazione per l'Evangelizzazione dei Popoli. Dal 2001 è Rettore della Chiesa di S. Egidio; dal 2002 Presidente dell'Arciconfraternita del SS.mo Sacramento e S. Maria della Neve.

Nel 2005 è stato nuovamente nominato Rettore della Pontificia Università Urbaniana. Attualmente offre la sua collaborazione anche nella Parrocchia di San Filippo Neri alla Garbatella. Dal 10 aprile 1998 è Cappellano di Sua Santità.

È autore di numerose pubblicazioni ed articoli di carattere biblico e spirituale su diverse riviste e dizionari specializzati.